BUNSEN本生带您了解：怎样分析ELISA试剂盒包被和封闭问题

　　一、 Elisa试剂盒包被方式

　　将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。

　　大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。

　　亲和素生物素即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，ELISA试剂盒这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。

　　优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。

　　二、包被用抗原

　　天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。

　　三、包被用抗体

　　IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，ELISA试剂盒抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。

　　腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。

　　四 、包被的条件

　　pH9.6碳酸盐缓冲液

　　pH7.2的磷酸盐缓冲液

　　pH7-8的Tris-HCL缓冲液

　　加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置，37℃中保温2小时。ELISA试剂盒包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。

　　二、Elisa试剂盒封闭问题

　　封闭是ELISA实验中的一个步骤，而封闭的重要性是在于实验模式的，今天上海恒远和您一起重点来看这个问题。

　　抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

　　封闭剂：

　　1. zui常用的是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。

　　2. 也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。

　　3. 脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其zui大的特点是价廉，可以高浓度使用(5%)。

　　4. 高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。

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